Batteri lattici nel impasti acidi diversi — un poolish e una biga.


Genotipizzazione di batteri lattici isolati da impasti acidi: valutazione di due
diverse tecnologie di produzione.

Le principali differenze date dall’utilizzo di un poolish e la biga.

Giornate del Dottorato in Scienze e Biotecnologie degli Alimenti 2007
Facoltà di Agraria, Alma Mater Studiorum — Università di Bologna, 29-30 Marzo 2007
Elena Caffarri

Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Alma Mater Studiorum — Università di Bologna;

Sede principale di attività: Dipartimento di Genetica, Biologia dei microrganismi, Antropologia, Evoluzione, Università degli Studi di Parma
Dottorato: Biotecnologie degli Alimenti;

Ciclo di dottorato: XXI; Anno di frequenza: II
Tutor: Prof.ssa Maria Elisabetta Guerzoni; Co-tutor: Prof. Erasmo Neviani

 

 
1. Stato dell’arte

Un impasto acido è una miscela di farina e acqua che viene fermentata con batteri lattici e lieviti (Vogel et al., 1999; DeVuyst e Gänzle, 2005) ed è soprattutto usata per la produzione di prodotti da forno. I suddetti microrganismi originano essenzialmente dalla farina, dagli ingredienti dell’impasto o dall’ambiente. I batteri lattici sono fondamentali nel determinare le proprietà degli impasti: le loro attività più importanti si esplicano esplicano durante la lievitazione e sono la fermentazione lattica, la proteolisi, la sintesi di composti volatili e anti-muffa (Gobbetti, 1998; Hammes e Gänzle, 1998).

I fattori endogeni dei prodotti dei cereali (carboidrati, fonti d’azoto, minerali, lipidi e acidi grassi liberi, attività enzimatiche) e i parametri di processo (temperatura, lieviti dell’impasto, attività dell’acqua, ossigeno, tempo di fermentazione) influenzano notevolmente la microflora dell’impasto acido e le caratteristiche del prodotto finito
(Hammes e Gänzle, 1998).
I batteri lattici responsabili dell’acidificazione dell’impasto sono soprattutto lattobacilli. Essi consistono in specie eterofermentanti obbligati e facoltativi e specie omofermentanti obbligati (Hammes e Vogel, 1995). Oltre ai microrganismi appartenenti al genere Lactobacillus, occasionalmente sono stati rilevati anche microrganismi
appartenenti ai generi Leuconostoc spp., Weissella spp., Pediococcus spp. e Enterococcus spp (De Vuyst e Neysens, 2005).

Inoltre, durante uno studio sulla produzione di sostanze antimicrobiche da parte di batteri lattici di impasti acidi, è stato isolato un ceppo che non poteva essere assegnato a nessuna specie conosciuta ne dal sistema API 50 CH ne dall’analisi di sequenza del gene 16S rRNA. Altri 5 isolati da farina italiana di impasti acidi hanno mostrato un’alta similarità con esso. E’ stata perciò proposta una nuova specie che è stata chiamata Lactobacillus rossii sp.nov.  In Europa esistono centinaia di differenti tipi di pane tradizionale, in particolare in Italia. Essi differiscono dal tipo di farina, dagli altri ingredienti, dalla tecnologia applicata e dal processo di fermentazione; gli impasti acidi di questi prodotti sono un’ importante fonte di specie diverse di batteri lattici e ceppi che possono essere metabolicamente attivi o possono essere riattivati in seguito all’addizione di acqua e farina. Essi sono fondamentali per la buona riuscita del prodotto e possono essere utilizzati anche come starter (De Vuyst e Vancanneyt, 2007)
Per studiare il polimorfismo genomico dei batteri lattici è in genere applicata la RAPD (Randomly Amplification of Polymorfic DNA) la quale prevede l’amplificazione del DNA genomico con un unico primer che si appaia casualmente sul DNA ogni volta che trova una sequenza complementare. Il profilo di amplificazione che si ottiene può essere paragonato ad un’impronta digitale che caratterizza in modo specifico il ceppo e rimane inalterato nel tempo.
Un precedente lavoro ha riportato lo studio di batteri lattici isolati da impasti acidi utilizzando 10 diversi primer con sequenza scelta arbitrariamente. Di questi soltanto 3 hanno dato un pattern di bande idoneo alla caratterizzazione genotipica e corrispondono alle sequenze 5’ ACGCGCCCT 3’; 5’ CCGCAGCGTT 3’; 5’ AGCAGCGTGG 3’ (Corsetti et al., 2003).

 
2. Bibliografia

Corsetti A, De Angelis M, Dellaglio F, Paparella A, Fox PF, Settanni L, Gobbetti M (2003) Characterization of
sourdough lactic acid bacteria based on genotypic and cell-wall protein analyses, J. Appl. Microbiol. 94: 641-654.
De Vuyst L, Gänzle MG (2005) Trends in food science & technology special issue- second international symposium on sourdough: from foundamentals to applications, Amsterdam: Elsevier, vol.16.
De Vuyst L, Neysens P (2005) The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions, Trends Food Sci. Technol. 16: 43-56.
De Vuyst L, Vancanneyt M (2007) Biodiverity and identification of sourdough lactic acid bacteria, Food microbiol. 24: 120-127.
Gobbetti M (1998) The sourdough microflora: interactions of lactic acid bacteria and yeasts, Trends Food Sci. Technol. 9: 267-274.
Hammes WP, Gänzle MG (1998) Sourdough breads and related products, In Wood BJB (Ed) Microbiol. Fermented Food, vol. 1, London: Blackie Academic and Professional, pp 199-216.
Hammes WP, Vogel RF (1995) The genus lactobacillus, In Wood BJB, Holzapfel WH (Eds) The lactic acid bacteria, vol. 2, The genera of lactic acid bacteria, London: Blackie Academic and Professional, pp 19-54.
Vogel RF, Knorr R, Müller MRA, Strudel U, Gänzle MG, Ehrmann M (1999) Non-diairy lactic fermentation: the cereal  world, Antonie van Leeuwenhoek 76: 403-411.

 

 
3. Obiettivi

Gli impasti acidi hanno senza dubbio una conservabilità maggiore grazie al valore minore di pH che influenza
l’idratazione delle proteine del glutine. Tuttavia il prodotto, una volta cotto, ha una shelf-life di pochi giorni a causa dell’insorgere di fenomeni come il raffermamento che comporta la perdita della freschezza, della croccantezza della crosta, l’aumento della rigidità della mollica e la perdita di aromi fondamentali. Queste problematiche, legate all’aumento della domanda dei prodotti da forno in campo industriale, hanno portato allo sviluppo di diverse tecnologie.
La tecnica più diffusa è quella della surgelazione che permette un aumento della shelf-life del pane. I prodotti più
diffusi adatti all’applicazione di questa tecnica sono di due tipologie: quelli parzialmente fermentati che devono subire l’ultima fase di lievitazione prima della cottura e i prodotti lievitati, parzialmente cotti, che richiedono solo la cottura finale. I primi quindi necessitano di un’ulteriore lavorazione molto delicata per la fase di lievitazione finale (controllo della temperatura), mentre i secondi spesso presentano caratteristiche organolettiche non ottimali. Infatti il congelamento comporta una ridotta capacità di trattenere l’anidride carbonica e una perdita di vitalità dei lieviti che dovrebbero completare la lievitazione. Nel nostro paese non è diffusa la tecnica del congelamento del pane totalmente lievitato e pronto per la cottura, che aumenterebbe la facilità di uso del prodotto salvaguardandone le caratteristiche organolettiche. Tuttavia questo processo non trova applicazione per il collassamento dell’impasto durante la cottura. La Pan Tecnology di Verona è riuscita a ottenere un prodotto lievitato da cuocere in forno partendo dal surgelato ed evitando quindi la fase di scongelamento indicando tutte le condizioni di cottura sul codice a barre del prodotto, rendendolo quindi accessibile anche a operatori non esperti. Il rischio di collassamento è stato evitato utilizzando un additivo che è coperto da segreto industriale. La fase di lievitazione però rappresenta il principale limite di questo processo, in quanto è richiesta la preparazione di una biga di circa 24 ore, e quindi circa l’80% dell’impasto deve essere
preparato il giorno prima con conseguenti danni logistici ed economici. Il lavoro di ricerca di dottorato si è posto l’obiettivo di evidenziare le principali differenze date dall’utilizzo di un poolish in alternativa alla biga, per un miglioramento delle condizioni operative e delle caratteristiche del prodotto finito.

 

4. Stato di avanzamento della ricerca e principali risultati

In questi mesi sono stati ottenuti risultati microbiologici e biotecnologici a supporto della tesi che differenzia i risultati ottenuti dall’utilizzo della biga e del poolish. La biga è stata preparata il giorno precedente impastando circa il 65% dell’impasto finale e utilizzando come starter microbico il Saccharomyces cerevisiae (in quantità del 2% sul peso della farina), a cui è seguita una fermentazione a 16 °C per 24 ore. Successivamente è stata rinfrescata con il 35% di acqua e farina formando un impasto che è stato ulteriormente fermentato per 30 minuti. A questo punto si è proceduto alla spezzatura dell’impasto e formatura ed infine le singole pezzature hanno subito un’ultima fermentazione per 60 minuti prima del congelamento. Il poolish invece, è stato ottenuto diluendo una madre acida matura con una fermentazione a 30 °C per 4 ore. Successivamente è stato aggiunto all’impasto finale in misura del 35% e lasciato lievitare per 90 minuti prima della pezzatura e del congelamento.
Una prima differenza è stata riscontrata nella misura del pH; infatti, prodotti ottenuti dall’aggiunta di poolish, una volta surgelati, hanno un pH più basso (4.74) rispetto al caso della biga (5.40). Questo andamento è sicuramente imputabile al diverso ruolo che esercitano i batteri lattici nelle due diverse produzioni; ne danno una conferma i risultati riguardanti la presenza di acidi e zuccheri nei due impasti. Si osserva un rapido incremento della concentrazione dell’acido lattico e un aumento meno significativo dell’acido acetico nel poolish durante le 4 ore di fermentazione, mentre dopo la formazione dell’impasto i due acidi sono presenti in quantità minori per l’effetto diluizione. Nella biga, invece, è preponderante l’acido lattico rispetto all’acido acetico, ad indicare una maggiore presenza di batteri lattici omofermentanti o l’incapacità di quelli eterofermentanti di deviare il loro metabolismo verso la produzione di acido acetico piuttosto che di etanolo. Anche l’andamento degli zuccheri indica la presenza di popolazioni microbiche differenti. Nel poolish sono infatti presenti quantità significative di maltosio che incrementa notevolmente nell’impasto finale; questo indica l’assenza di microrganismi come il Saccharomyces cerevisiae in grado di idrolizzarlo. Lo stesso non accade nel caso della biga, in cui prevale questo lievito, e quantità discrete di questo zucchero sono rilevabili solo dopo il rinfresco della stessa. Inoltre, a conferma di ciò, l’elevata presenza di glucosio, non osservabile nel caso del poolish, può essere dovuta all’attività delle invertasi di questo lievito che spezzano il maltosio in due molecole di glucosio. Il fruttosio risulta presente in basse quantità nel poolish e in quantità trascurabili nella biga e, non essendo
utilizzato direttamente né dai batteri lattici né dai lieviti, si riflette nell’accumulo di mannitolo nel poolish durante la fermentazione. Infatti, il fruttosio viene ridotto a mannitolo da molti batteri lattici eterofermentanti tipici degli impasti acidi.
Un altro aspetto molto importante di questo lavoro riguarda l’analisi biotecnologica. Da ogni campione di biga e poolish sono stati prelevati 10 g di campione e diluiti in 90 ml di soluzione fisiologica. Successivamente è avvenuta l’omogeneizzazione in stomacher per 5 minuti e la diluizione in provetta fino a un miliardo e dieci milioni rispettivamente per i batteri lattici e i lieviti. I batteri lattici sono stati isolati, con inoculo in doppio strato, utilizzando due tipologie di terreno: MRS e SDB. I terreni inoculati sono stati messi a incubare a 30 °C per 48 ore. I successivi passaggi di purificazione sono stati fatti con la tecnica dello striscio su piastra mantenendo la stessa tipologia dei terreni utilizzati durante gli isolamenti.  Non sono state effettuate purificazione sui lieviti perché si è voluto dare maggior attenzione all’attività dei batteri lattici. Per un’ulteriore verifica della purezza degli isolati, ne è stata osservata la morfologia al microscopio (cocchi e bastoncini).
Per la biga gli isolamenti sono stati fatti al tempo 0, dopo 12 ore di fermentazione e dopo 24 ore di fermentazione
mentre per il poolish sono stati eseguiti al tempo 0 e dopo 4 ore di fermentazione. Infine, per gli impasti di poolish e biga gli isolati sono stati prelevati al tempo 0 di pre-fermentazione, a fine fermentazione e sul congelato di 24 ore.
In totale per le analisi biotecnologiche si sono ottenuti:
• 8 isolati da biga in MRS
• 14 isolati da impasto in MRS
• 13 isolati da biga in SDB
• 14 isolati da impasto in SDB
• 7 isolati da poolish in MRS
• 31 isolati da poolish in SDB
Come riferimento sono stati i utilizzati 5 type delle specie Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus fermentum, Weissella confusa e Lactobacillus sanfranciscensis.
Al fine di poter caratterizzare genotipicamente i ceppi isolati si è proceduto all’estrazione del DNA con due diverse tecniche: estrazione meccanica con bead beater ed estrazione con metodo chelex 5%. Successivamente si è quantificato il DNA con lettura spettrofotometrica a 260 nm. Dopo aver estratto il DNA sono state eseguite delle PCR-RAPD con due diversi primer: M13 e P1 (5’ GAGGGTGGCGGTTCT 3’ e 5’ ACGCGCCCT 3’, rispettivamente). Essi sono costituiti da poche basi e questo conferisce loro una bassa specificità, per cui possono appaiarsi in maniera casuale in più regioni del DNA dando origine a un profilo genetico.
I profili RAPD di tutti i ceppi sono stati sottoposti ad analisi dei cluster. Il calcolo di similarità delle bande dei profili è stato basato sul coefficiente di similarità di Pearson che ha consentito di ottenere un dendogramma da una matrice di similarità usando il metodo UPGMA (unweighted pair group method).
L’utilizzo di due diversi primer ha consentito una discriminazione sia sulla provenienza dei ceppi (biga e poolish), sia sulla tipologia di terreno di coltura utilizzato in fase di isolamento. Dal dendogramma ottenuto è stato possibile evidenziare che i ceppi isolati da poolish clusterizzano in gruppi ben separati da quelli isolati da biga. Inoltre i type clusterizzano a sé con due ceppi provenienti da biga. Questo dato sottolinea come questo metodo di caratterizzazione (RAPD) sia più utile a evidenziare la variabilità genetica piuttosto che l’appartenenza ad una specie.
Sicuramente si può affermare che i ceppi si raggruppano in funzione del terreno di coltura da cui sono stati isolati. A questo proposito è stato possibile notare che il profilo elettroforetico che origina il primer M13 non permette questa differenziazione all’interno dei singoli cluster, differenza che invece risalta nei profili generati dal primer P1. Si può ipotizzare quindi che i due diversi terreni di coltura comportino lo sviluppo di ceppi (e forse anche specie) diversi e che i risultati delle conte in piastra ottenute dai due diversi terreni nutritivi debbano essere considerati come additivi piuttosto che come complementari o parzialmente sovrapponibili.
Un’ultima considerazione ci permette di affermare che non è tuttavia possibile discriminare i vari ceppi in base al tempo di campionamento. Questo è un indice del raggiungimento dell’equilibrio della flora microbica nell’impasto acido senza avvicendamento delle specie ed evoluzione ecologica: le specie/ ceppi presenti inizialmente permangono per tutto il tempo di fermentazione.
Ulteriori sviluppi di questa ricerca prevedono l’identificazione dei ceppi effettuando analisi RAPD con altri due primer (P4 e P7 con sequenza rispettivamente 5’ CCGCAGCGTT 3’ e 5’ AGCAGCGTGG 3’) e PCR specie-specifiche con primer adatti al riconoscimento delle specie più plausibili presenti in questi impasti acidi.

Autore: Elena Caffarri

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